作者
Alec M. Giakas, Ran Hee Choi, m.s.， Ho-Jin Koh, Ph.D。

摘要

有规律的体育活动是通过增加脂肪酸代谢来预防肥胖的推荐策略。amp活化蛋白激酶(AMPK)与脂肪组织中脂肪分解的激活有关。此外，有研究表明，单次运动可以增加脂肪细胞中的AMPK活性;然而，AMPK调节运动诱导的脂肪细胞代谢的机制尚未确定。为了研究AMPK在运动诱导的脂肪细胞代谢中的作用，我们使用了脂肪特异性AMPK α 1和α 2敲除小鼠(FKO)。野生型(WT)和FKO小鼠分为久坐组(Sed)和运动组(EX)。经过6周的运动训练，两组之间的体重和食物摄入量没有差异。然而，与WT相比，FKO小鼠的瘦体成分显著增加(86.90%比83.89%)，脂肪成分显著降低(13.10%比16.21%)(p<0.05)。此外，与WT相比，FKO小鼠在训练5周后的葡萄糖耐量也有所改善(p<0.01)。为了确定AMPK是否调节运动诱导的脂肪分解，我们测量了AMPK磷酸化位点Ser565上激素敏感脂肪酶(HSL)的磷酸化水平。 The phosphorylation of HSL at Ser565 was significantly reduced in FKO mice (p<0.05). Furthermore, we examined if AMPK affects exercise-induced beige fat formation in white adipose tissue (WAT) by examining known fat browning markers UCP1, Cidea, and PRDM16. Although UCP1 mRNA expression did not differ, Cidea (p<0.01) and PRDM16 (p<0.01) mRNA expressions were significantly increased in FKO mice. In conclusion, our results demonstrate that manipulation of adipocyte AMPK may affect body fat composition, glucose homeostasis, lipolysis, and beige fat formation, suggesting its potential to serve as a therapeutic target for the treatment of various metabolic disorders.

介绍

肥胖在美国已经成为一个严重的问题。超过70%的美国成年人被认为超重，肥胖和糖尿病的发病率超过了美国人口的35%。这种肥胖的流行导致了成人中几种慢性疾病的患病率增加，因为BMI为30或更高是二型糖尿病、高血压、脂肪肝、中风和某些癌症的一个被证实的危险因素。此外，肥胖已被证明是心血管疾病的危险因素，心血管疾病是美国的主要死亡原因(Singer & Lumeng, 2017;Stender et al.， 2017)。据报道，减少肥胖可以改善糖尿病的血糖控制，从而限制胰岛素抵抗(Leong, King Sun, and John P. Wilding, 1999)。此外，增加体力活动和运动训练是得到良好支持的增加脂肪细胞代谢和限制肥胖的治疗方法(Horowitz, J.F. and Klein, S.， 2000)。然而，许多控制运动训练对肥胖调节作用的潜在机制尚不完全清楚。

脂肪细胞调节的可能机制之一是脂肪组织中amp活化的蛋白激酶(AMPK)的激活。AMPK是一种能量感应丝氨酸/苏氨酸激酶。AMPK在葡萄糖摄取和脂肪酸氧化以及其他分解代谢能量产生途径中发挥关键作用，是一个需要调节的完整信号分子

能量短缺时骨骼肌的葡萄糖摄取(Towler & Hardie, 2007)。在所有真核细胞中都有发现，它被细胞AMP/ATP比率的增加所激活，而细胞AMP/ATP比率的增加可能是由于葡萄糖或氧气被剥夺而产生的ATP过少，也可能是由于肌肉过度收缩和运动等因素导致ATP消耗过度。AMPK通过上游激酶的磷酸化激活，如LKB1 (Hwang, Kwon， & Yoon, 2009)。一旦被激活，AMPK开启产生ATP的分解代谢途径，同时关闭消耗ATP的过程，如细胞生长和增殖。

据了解，AMPK在脂肪细胞代谢中起重要作用。具体来说，有人认为AMPK可以调节激素敏感的脂肪酶活性(Koh HJ, Hirshman MF, He H et al.， 2007)，这已被证明有助于脂肪细胞的脂肪分解(Holm C.， 2003)。另一项研究表明，AMPK抑制突变体的过表达会损害3T3-L1脂肪细胞的脂肪分解，表明AMPK活性会增加脂肪细胞的脂肪分解(Yin W, Mu J, Birnbaum MJ, 2003)。此外，脂肪细胞特异性AMPK已被证明通过降低棕色和米色脂肪组织功能来加剧胰岛素抵抗和肝脂肪变性(Mottillo等，2016)。先前的研究表明，AMPK水平在大鼠(Ruderman, N. B.， H. Park, V. K. Kaushik, D. Dean, S. Constant, M. Prentki和A. K. Saha, 2003)和人类(Watt, M. J.， Holmes, A. G.， Pinnamaneni, S. K.， Garnham, A. P.， Steinberg, G. R.， Kemp, b.e.， feb . braio, 2006)运动后升高。

AMPK激活的净效应导致脂肪酸氧化增加和甘油脂合成减少，但这些发现与AMPK激活减少肥胖的能力之间的相关性仍有待阐明(Ruderman, N. B.， H. Park, V. K. Kaushik, D. Dean, S. Constant, M. Prentki和A. K. Saha, 2003)。在本研究中，我们选择检测AMPK FKO对附睾脂肪的影响，因为它比皮下脂肪研究得少。我们的初步数据表明，慢性运动可以减少脂肪量，增加脂肪细胞中AMPK催化亚基活性(图1)。然而，AMPK信号的存在与运动诱导的脂肪细胞代谢之间的直接机制尚未确定。

因此，我们假设AMPK通过调节脂肪分解、葡萄糖稳态、棕色脂肪形成和脂肪细胞组成，在小鼠运动诱导的脂肪细胞代谢中发挥重要作用。

图1所示。慢性运动增加大鼠脂肪细胞AMPK α1和α2活性。(A) 6周的运动训练在不改变体重的情况下有效地减少了脂肪重量。(B和C)研究前训练6周并休息30小时的大鼠附睾脂肪AMPK α1和α2活性。每组N =6。*表示p<0.05， **表示p<0.01。

材料与方法

动物

动物使用方案和实验程序按照美国国立卫生研究院的指导方针进行，并得到南卡罗莱纳大学机构动物护理和使用委员会的批准。bob官方体育登陆使用Cre-loxp重组系统，通过将从Jackson实验室购买的带有固定AMPK α1和α2基因的C57BL/6品系小鼠与由Beth Israel Deaconess医疗中心的Rosen博士赠送的脂联素- cre转基因C57BL/6小鼠杂交，产生脂肪特异性AMPK敲除小鼠。雄性AMPK FKO小鼠和它们的野生型幼崽在标准的12小时光照/12小时黑暗周期下被饲养在无病原体的动物设施中，并被维持在食物饮食中(20%的卡路里来自脂肪;实验室饮食5020)。小鼠在12-15周龄时进行研究，如图图例所示。每周的测量包括体重、血糖和食物摄入量。DEXA扫描测量分别在训练前、训练三周后和训练六周后进行。训练第5周后测量GTT。

运动训练

运动组小鼠每天在跑步机上训练1小时，持续6周。在第一周，小鼠以12m/min的速度在5%坡度下跑步。在第2-6周，小鼠以5%倾斜度16 m/min的速度跑步。而久坐组的对照组则没有进行这种运动训练。

PCR方案及分析

使用Cre-loxp重组系统从AMPK FKO小鼠和使用RNeasy Mini Kit (Qiagen)的WT窝鼠的脂肪样本中提取总RNA。用逆转录酶(Sigma)合成第一链DNA。将每个引物归一化为18S RNA的PCR产物计算相对mRNA水平。

Western Blot分析和抗体

收集附睾脂肪，制备蛋白裂解物进行Western Blot分析。组织和细胞在裂解缓冲液中快速处理。Western blot分析用于评估各种分子的蛋白和磷酸化水平。从商业来源购买的一抗包括GAPDH;AMPKa1;pAMPK;ACC;扣带皮层部位;奥软;pHSL S565; pHSL S660 (Cell Signaling). Secondary antibodies used were horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-rabbit (Amersham), HRP-conjugated anti-mouse (Upstate), and HRP-conjugated anti-goat (Promega). All the indicated antibodies were used at the dilutions suggested by the manufacturer. Blots were developed using ECL reagents (Amersham Pharmacia), and bands were visualized and quantified using ImageJ (NIH).

统计分析

所有数据均采用学生t检验、单因素方差分析或双因素方差分析进行比较。p < 0.05为组间差异显著。

结果

1.敲除脂肪特异性AMPK会影响脂肪细胞形态并改善身体成分

在为期6周的训练中，每周测量食物摄入量和体重。基因型之间的食物摄入量没有变化(A)，而体重(B)仅在训练的第三周发生显著变化(p = 0.036)。FKO组整体体成分显著改善。3周后的DEXA显示平均WT体脂率为21.43%，而平均KO体脂率为16.38%。同样，在跑步机训练三周后，WT小鼠的瘦质量百分比明显降低。WT平均瘦质量为78.92%，KO平均瘦质量为83。98%。这种趋势持续了6周，训练后的FKO小鼠的总脂肪质量百分比明显低于WT训练组(C)，训练后的FKO小鼠的总瘦质量百分比明显高于WT训练组(D)。有趣的是，附睾脂肪组织的H&E染色(E)证实，AMPK FKO增加了久坐组附睾脂肪的脂肪细胞直径(F)和横截面积(G);然而，这些影响在运动训练组完全消失了。最后，AMPK FKO显著降低运动训练组的附睾脂肪垫重量(H)。

图1:在TM组和SED组中招募AMPK脂肪特异性敲除和野生型窝仔。TM进行了为期6周的训练，每天1小时，16米/分钟，坡度5%。TM或SED治疗6周后，收集附睾(Epi)脂肪。(A)每周测量一次的平均食物摄入量，(B)每周测量一次的平均体重(C) WT与FKO运动后脂肪质量百分比(D) WT与FKO运动后脂肪质量百分比(E)亚脂肪细胞的h&e染色(F)横截面积量化和(G)直径(H)外皮脂肪垫质量KO/WT±S.E.M, n=8/组。*表示p<0.05， *** p<0.001 vs. Sed;###表示与WT相比p<0.001。

2.AMPK FKO降低附睾脂肪AMPK及其下游蛋白

通过Western Blot分析和测定附睾脂肪中AMPK蛋白的相对表达量，确定AMPK FKO组的基因型。不出所料，FKO组附睾库AMPKα1 (A)和磷酸化AMPK (C)均显著降低。此外，我们还分析了乙酰辅酶a羧化酶(acetyl CoA carboxylase, ACC)的表达，因为它是AMPK的一个敏感下游。在FKO小鼠中，磷酸化ACC与总ACC的比值(E)显著降低。此外，测定总HSL和磷酸化HSL水平。AMPK使HSL的565丝氨酸磷酸化，而另一种分子PKA使HSL的660丝氨酸磷酸化。正如预期的那样，FKO小鼠中565 (G)丝氨酸磷酸化的HSL显著降低，而FKO对660 (I)丝氨酸磷酸化的HSL水平没有影响。

图2:对附睾(Epi)脂肪组织进行Western Blot以量化蛋白表达。(A) AMPKα1和(B)相对定量。(C) pAMPK和(D)相对表达。(E)总ACC和磷酸化ACC， (F)相对定量。(G)总HSL和磷酸化HSL Ser 565; (H)相对定量。(I)总HSL和磷酸化HSL Ser 660及(J)相对定量。数据为平均值±s.e.m.， n=4-5/组。#表示P<0.05， ##表示P<0.01。

3.敲除AMPK可改善葡萄糖稳态

训练5周后，对小鼠进行葡萄糖耐量试验(GTT)以测量葡萄糖稳态。GTT显示，FKO小鼠在120分钟内血糖稳态显著改善(A)。

图3:(A)葡萄糖耐量试验(GTT)，空腹过夜后给小鼠注射2g /kg体重的葡萄糖，每15分钟测量一次血糖水平，持续120分钟，(B)对结果进行量化。数据为平均值±S.E.M, n=4-5/组。#表示P<0.05， ##表示P<0.01。

4.AMPK的缺失增加了运动后的脂肪褐变标记物

使用附睾脂肪样本的RT-PCR mRNA分析来测量棕色脂肪形成的几种标记物。虽然UCP1 (A)或Dio2 (B)的mRNA水平没有显著变化，但与久坐组相比，FKO训练组的附睾脂肪PRDM16 (C)和Cidea (D)的mRNA水平均显著升高。

图4:(A-D)褐变标志物(A) UCP1， (B) PRDM16， (C) Dio2， (D) Cidea mRNA表达量。数据为平均值±s.e.m.， n=3-4/组。**表示P<0.01，与Sed比较。

讨论:

2型糖尿病、心血管疾病和肥胖是美国高患病率的代谢性疾病。最近，代谢代谢研究的进展使人们对脂肪细胞的发育和分化有了更深入的了解，这标志着这些代谢疾病有了新的治疗选择(Walden, Hansen, Timmons, Cannon， & Nedergaard, 2012)。本研究的结果表明，通过持续的有氧训练，敲除脂肪组织中的AMPK可以显著改善身体组成，减少脂肪质量百分比，增加瘦质量百分比。与皮下脂肪不同，我们的实验室已经证明，在久坐组和训练组中，敲除AMPK会减少脂肪细胞的大小，而在久坐组中，AMPK的FKO会增加附睾脂肪的脂肪细胞直径和横截面积。然而，这种脂肪细胞大小的增加在运动组完全得到了改善。事实上，AMPK FKO结合运动可以显著降低附睾脂肪垫组织质量。这些结果表明，敲除AMPK可以通过显著降低患者的脂肪细胞大小和总脂肪量，与运动相结合，为肥胖提供有效的治疗。

已知AMPK在能量平衡中发挥作用，有人认为AMPK水平的操纵可能在2型糖尿病和代谢综合征的药物治疗发展中发挥重要作用(Towler & Hardie, 2007)。除了AMPK对脂肪代谢的影响外，我们的研究结果还证明了AMPK对葡萄糖代谢和体内平衡的调节。事实上，在目前的研究中，AMPK FKO小鼠在葡萄糖注射后120分钟内表现出显著改善葡萄糖稳态，这表明敲除AMPK可以改善患者的葡萄糖摄取并降低胰岛素抵抗。因此，下调脂肪组织中的AMPK可以通过改善患者对葡萄糖的敏感性和代谢，对II型糖尿病起到有益的治疗作用。

脂肪组织由脂肪细胞组成，脂肪细胞以甘油三酯的形式储存能量。当需要能量时，比如在运动时，脂肪分解开始，导致甘油三酯分解为游离脂肪酸，为工作的骨骼肌提供燃料。人类有三种类型的脂肪细胞:一种是在传统白色脂肪组织(WAT)中发现的储存能量的白色脂肪细胞，一种是在棕色脂肪组织(BAT)中发现的燃烧能量的棕色脂肪细胞，第三种是在WAT中出现的“米色”或“白色”脂肪细胞，但保留了BAT的代谢活性(Ohno, Shinoda, Spiegelman， & Kajimura, 2008)。BAT和米色脂肪都积极参与产热。研究表明，增加产热是提高基础代谢率的一种方法，从而增加每日能量消耗，为对抗肥胖流行提供了一种有吸引力的替代机制(Whittle et al.， 2011)。本研究表明，当与运动结合时，敲除附睾脂肪中的AMPK可显著增加几种褐变标志物。这表明，减少脂肪中AMPK的表达可以作为一种治疗肥胖的方法，通过诱导产热来增加棕色脂肪的活性。

总之，这些结果表明，敲除AMPK可以作为几种代谢性疾病的有价值的治疗方法，包括肥胖和II型糖尿病，以及其他与肥胖密切相关的疾病，如心血管疾病和脂肪肝疾病。这项研究适用性的一个限制是在人类脂肪组织中进行AMPK敲除的能力。然而，这可以通过开发药物来克服，这些药物旨在灭活AMPK或其上游调节因子，从而下调其作用。未来的研究需要调查信号分子的潜在机制，如AMPK，可以引起这些有益的表型变化。

作者简介

亚历克·m·贾卡斯

Alec Michael Giakas目前是南卡罗来纳州哥伦比亚市南卡罗来纳大学医学院的二年级医学生。他作为BARSC-MD计划的成员获得了bob官方体育登陆南卡罗来纳大学荣誉学院的学士和学士学位。Alec在运动科学系Ho-Jin Koh博士的分子代谢实验室完成了两年的本科研究，研究AMPK对代谢不同方面的影响。亚历克还研究了慢性疼痛和自杀之间的关系;锁定髓内固定螺钉在股骨粗隆间骨折修复中的应用牙龈病、小血管病与脑血管意外的关系糖尿病患者足部疾病的患病率。

参考文献

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